通过移植转基因的表皮干细胞治疗JEB

原作者：Fulvio Mavilio1, Graziella Pellegrini1,2, Stefano Ferrari2, Francesca Di Nunzio1, Enzo Di Iorio2,Alessandra Recchia1, Giulietta Maruggi1, Giuliana Ferrari3, Elena Provasi4, Chiara Bonini4, Sergio Capurro5, Andrea Conti6, Cristina Magnoni6, Alberto Giannetti6 & Michele De Luca1,2

原文链接：http://www.debraitaliaonlus.org/nature.pdf

周迎春，初次翻译：2011年6月，最后更新:2012/12/04

1 生物医学系，意大利摩德纳大学[University of Modena and Reggio Emilia]，Via Campi 287, 41100 摩德纳, 意大利。
2 上皮干细胞研究中心，威尼托眼库基金会，H. SS Giovanni and Paolo, Castello 6777, 30100 威尼斯, 意大利。
3 Istituto Scientifico H. San Raffaele-Telethon Institute for Gene Therapy (HSR-TIGET) and Vita-Salute University, and
4 Cancer Immunotherapy and Gene Therapy Program, Istituto Scienti?co H. San Raffaele, Via Olgettina 58, 20132 Milano, Italy.
5 Division of Plastic Surgery, H. San Martino, Largo Rosanna Benzi 10, 16132 Genova, Italy.
6 Department of Internal Medicine, University of Modena and Reggio Emilia, Via del Pozzo 71, 41100 Modena, Italy.

Correspondence should be addressed to M.D.L. ([email protected]) or F.M. ([email protected]).

Received 8 June; accepted 11 October; published online 19 November 2006; doi:10.1038/nm1504

发表于《自然医学》[NATURE MEDICINE]杂志

人类表皮的不断更新是由表皮基底层和毛囊中的干细胞维持的1,2。培养角化细胞干细胞（能全克隆[holoclone]3-6）产生皮片，用于修复严重的皮肤、粘膜和角膜缺陷7-9。编码基底膜中层粘连蛋白-5（LAM5）的基因突变造成交界型EB（JEB），这是一种破坏性的常常是致命的皮肤粘合疾病10。 把表达LAMB3 cDNA（编码LAM5-β3）的逆转录病毒载体导入了一名成年患者受LAM5-β3缺陷JEB影响的表皮干细胞，用于培养基因修正的表皮皮片。9块皮片 移植到了患者腿上的手术区域。8天后植入成功。观察到合成和组装了正常水平的有功能的LAM5，同时产生了牢固附着的表皮，并在没有水疱、感染、炎症或免 疫应答的情况下稳定的在整个观察期（1年）持续。逆转录病毒整合位点分析表明再生表皮全部由转染后的干细胞维持。这些数据表明JEB的体内基因治疗是可行 的，并 望实现疾病的全部功能纠正。

报名参加I/II期临床试验的患者是一名36岁的男性（索引号是KEP25），患非致命的JEB。他携带一个无效等位基因和一个单点突变（E210K）的双杂合LAMB3基因（编码LAM5-β3），损害了LAM5（参见11）的正常装配。他从出生起即受自发或小创伤后生成的水疱影响，然后病灶感染（图1a）。他大部分身体被大块难以愈合的水疱或有感染的痂覆盖，另有少数中度感染的区域（图1a，b）。为选择适于做表皮干细胞矫正的供体位置，我们从他身体的不同区域取皮做了角化细胞克隆分析。可能是由于伤口愈合过程中持续的增殖刺激，患者身上多数皮肤（图1b）都无法分离出具有克隆源性[clonogenic]并能 全克隆的细胞。只有他手掌上有足量的全克隆。


图1 患者KEP25的皮肤分析。(a) LAMB5-β3缺陷导致皮肤持续起疱（左，黄色箭头），最后结痂（左，黑色箭头），或不愈合的感染病灶（右，黑色箭头）。比例尺，3.5厘米。 (b) 从病人身体的不同部位钻孔活检，然后培养角化细胞。根据补充方法的描述评估集落形成率[Colony-forming efficiency]（CFE）。与健康对照相比，轻度（绿色）和中度（黄色）损伤的身体部位检测出的角化细胞克隆源性和干细胞（全克隆）依次降低。在重度损伤（粉红）或未愈合（红色）的区域检测不出集落形成细胞。

在莫罗尼[Moloney]白血病病毒（MLV）长末端重复序列（LTR）（图2a）的控制下，用表达全长LAMB3 cDNA的逆转录病毒转染从两个手掌活检取得的KEP25原代角化细胞（1.5cm2）。细胞质LAM5-β3的免疫荧光分析显示克隆源性细胞几乎100%被转染（图2b）。基因组DNA的Southern印迹分析[Southern blot analysis]表明平均每个基因组中有两份完整的载体拷贝，没有重排前病毒的迹象（图2c）。总RNA的Northern分析表明，符合预期大小的单个载体产生的mRNA大量累积（图2d）。LAM5-β3特异抗体免疫沉淀获得了一些异源三聚的LAM5，与普通角化细胞产生的几乎无法区分（图2e）。未经转染的KEP25手掌角化细胞中几乎检测不出LAM5-β3蛋白质和LAMB3 mRNA（图2b,d,e）。转基因的表达在培养物的整个生命期都保持在相同水平（>120细胞增值，数据没有显示）。

图2 矫正KEP25的表皮细胞LAM5-β3缺乏症。（a）MFG-LAMB3逆转录病毒载体简图。LTR： 长末端重复序列；env：MLV囊膜糖蛋白基因的前导序列；γ：包装信号。LAMB3片段用作Southern和Northern分析的探针。这里显示了用KpnI（4.4kb）和SstI（1.0和4.6kb）限制性内切后探针检测到的条带的大小和位置。（b）用MFG-LAMB3对KEP25转染前（左）后（右）角化细胞培养物表达的LAM5-β3的免疫荧光分析（绿色，下面）。比例尺，100微米。 （c）使用KpnI或SstI消化，并与LAMB3特异性探针 杂交后，对正常（1）的和KEP25转染前（2）、后（3）的角化细胞培养物做DNA的Southern印迹分析。出现预期大小的条带说明没有重排前病毒。e*：内源性LAMB3片段。 （d）对正常（1）的和KEP25用MFG-LAMB3转染前（2）、后（3） 的角化细胞培养物做DNA的Northern印迹分析。印迹曝光24小时（左）或8小时（右）。标出了5.6-kb的载体特异性转录。e*：内源性LAMB3 mRNA。对甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的表达归一化以后，通过感光成像仪估计源于载体的转录与对照组相比超量表达约5倍。 （e）对正常（1）的和KEP25用MFG-LAMB3转染前（2）、后（3） 的角化细胞培养物35S标记的LAM5异源三聚体做免疫沉淀分析，表明转染细胞中LAM5完成重建。

我们选择了患者腿前面的区域做移植，这里表皮非常脆弱并有几处感染的不愈合的伤口。我们在局部麻醉下使用Timedsurgery12[厂商名，提供一种皮肤科的设备]清除了有LAM5-β3缺陷的残余表皮（附图1，在线）。我们在右腿移植了四片，左腿移植了五片转基因的皮片，每片55cm2（共约500cm2）。我们观察到双腿的表皮在8天内完全再生，在整个一年的观察期内表皮外观保持正常（图3a，附图1）。即使引入机械应力，再生的表皮仍保持强劲、不痒也不产生水疱（附图1），同时在移植区域周围可以看到自发的大疱。 临床表现在整个观察期内稳定，期间表皮至少经历了12次完整的更新周期。我们在第1个和第4个月对左右腿做了活检并提取了DNA，然后做了半定量PCR分析。在左右活检中都扩增到了符合预期大小的载体特异性条带（图3b）。考虑到表皮层的细胞在活检中（全层）只是一小部分，PCR信号强度与移植表皮完全转染相符。事实上，在第4个月的多个部分的活检皮片原位杂交显示源于载体的LAM5-β3副本几乎分布到了所有再生表皮细胞中（图3c和附图1）。

通过组织学分析，我们在双腿第1、4、6、12个月的活检中观察到正常并完全分化的表皮，具有生长良好的棘层、粒层和正常的真皮表皮交界（图3c，附图1）。角质层的厚度，以及手掌特异的角蛋白-9的合成（数据未显示），反映出移植角化细胞的组织来源。

免疫荧光分析表明，再生表皮的LAM5-β3含量与正常的对照组相似，并恰当的位于表皮-真皮交界处（图3d,e和附图1）。基底层的LAM5-γ2和α6β4整合素染色呈阳性，而通常在LAM5缺失的时候它们会减少，这表明转染的角化细胞表达出了足量的β3链，能在正确的位置装配出适当数量的LAM5 α3β3γ2异源三聚体（图3e，附图1）。最后，ΔNp63α转录因子13,14，它的表达与在体内15获得长期增殖潜能的基底角化细胞相关，在体外16,17与 全克隆相关，也在转基因表皮和对照表皮的数量接近的细胞中有类似的表达水平（图3e，红色箭头）。

 图3 基因矫正后功能 性的表皮再生。（a）转基因后培养的皮片移植到准备好的右大腿伤口上（植皮）。在移植后第8天和1-12月做了随访检查（见附图1）。移植后的1、4、6、12月做了活检（直径 都是0.4cm）。标尺：3.5cm。（b）对右小腿在第1和4个月活检提取的DNA用两个载体特异性引物做了半定量PCR分析。 转染的角化细胞（TK）培养物，纯的或按50%到1%比例用未转染细胞的DNA稀释，作为阳性对照。M：分子量标记; C1：反应混合物；C2：未转染角化细胞的DNA；箭头指示预期的315-bp扩增带。（c）4 个月的左腿活检中5毫米厚切片的苏木素/曙红染色，显示出完全分化的表皮，粘附到下面的真皮上（上图）。该角质层（中括号）的厚度属于典型的手掌表皮。用 载体特异探针与同一左腿活检的5毫米厚切片原位杂交表明在所有表皮层存在LAM-β3副本（中图），这符合转基因表皮细胞的植皮。白色虚线表示基底层。健 康皮肤的切片用作对照（下图）。细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚[4,6-diamidino-2-phenylindole]染色（DAPI， 红色）。第1和第6个月也得到了类似的结果。标尺，50毫米。（d）KEP25（左）和健康对照（右）的皮肤切片LAM5-β3表达（绿色箭头）免疫荧光分析。 左图的白色虚线表示基底层。标尺，100毫米。（e）4个月后活检的皮肤切片的免疫荧光分析。右腿（右上）上观察到的LAM5-β3表 达（绿色）几乎与健康人（左上）没有区别。第6和第12个月结果类似。转基因表皮正常合成了LAM5-γ2（中左）和α6β4整合素（中右），而LAM5 缺失时它们会减少。ΔNp63α转录因子的表达在转基因（右下）皮肤和正常皮肤基底膜（左下）中的模式类似，而其表达 与表皮再生能力有关。标尺：左上图100毫米，其它50毫米。

患者的复合LAMB3突变允许携带单氨基酸替换（E210K）11的LAM5-β3的残留合成（<正常水平的5%，图2b,e和图3d）。我们采用基于肽键预测[peptide-binding prediction]算法18的反向免疫学方法，分析了围绕替换的患者I类HLA分子（HLA-A*01/*0301, HLA-B*3503/*3801, HLA-Cw*0401/*1203）所有可能的9肽序列的化学键，发现潜在的结合力[potential binding score]非常低（<2）。同样，也预测对这名患者的II类表现型（DRB1*1101/*1301, DQB1*0301/*0603）没有潜在的II类限定应答[no potential class II–restricted response was predicted for the patient’s class II phenotype]。我们用Western印迹分析法（图4a,b），免疫沉淀法和免疫组织化学法（数据未显示）在患者的血清中查找源于载体的LAM5-β3的抗体，结果为阴性。为了测试I类限制性细胞毒性免疫应答，用MFG-LAMB3逆转录病毒载体转染辐射后的自体T细胞，或为对照患者的免疫能力，用异体T细胞，刺激移植后1到7月抽取的外周血单个核细胞。 我们在有正常异体基因目标应答的任何测试样本中既没有发现细胞毒性，也没有发现对自体LAMB3转染的淋巴母细胞细胞系目标的IFN-γ应答 （图4c，d）。在整个跟踪期内，我们获得的皮肤切片无炎性细胞浸润迹象。

图4 对LAM5-β3没有体液或细胞毒性免疫应答。（a，b）对患者血清中LAM5-β3抗体（anti-LAM5-β3）的Western印迹分析。（a）用SDS-PAGE凝胶提取正常角质蛋白，转印到尼龙膜上，再用KEP25移植前和移植后4、6月后的未稀释的血清培养，然后施加羊抗人IgG血清。（b）作为阳性对照，用1:1,000到1:1,000,000患者血清稀释的鼠抗LAM5-β3血清培养，然后施加羊抗鼠IgG血清。（c）细胞毒T细胞检测。移植后1个月（左图）和4个月（右图）的外周血单个核细胞（PBMCs），用辐射过的MFG-LAMB3 逆转录病毒载体转染后的自体T细胞，或辐射过的自体T细胞做了两轮刺激。经定量PCR估计，自体T细胞的转导效率在20-30％。源于载体的LAMB3 mRNA的表达用RT-PCR检查过。在第一次（上图）或第二次（下图）刺激后10天，增加效/靶比（E/T）验证了效应细胞的溶胞活性。用转染后的自体 T细胞（全系）刺激的效应细胞，又用自体LAMB3逆转录病毒载体转染的永生性埃-巴二氏病毒（EBV）[Epstein-Barr virus，也叫EB病毒，和大疱性表皮松解症的缩写EB没有关系]刺激（三角形）。未转染的EBV系（圆形）作为阴性对照。用异基因T细胞（虚线）刺激 的效应细胞又用同种T细胞（十字），和自体T细胞（方形） 刺激。[译注：这里写的标示好像与图不一致，但原文如此]。（d）γ干扰素（IFN-γ）释放法。移植后第1、4、7月的外周血单个核细胞用辐射过的自体MFG-LAMB3转染的T细胞或辐射过的异基因T细胞刺激三轮。用转染的自体T细胞（左图）刺激效应细胞，然后再用自体MFG-LAMB3转染的EBV系（白色柱）或未转染的EBV系（黑色柱） 刺激，作为阴性对照。用自体T细胞刺激效应细胞（右图），然后用同一T细胞（白色柱）和自体T细胞（黑色柱）刺激。24小时后，提取上清液并通过酶联免疫吸附定量测试IFN-γ。

作为临床试验安全性评估的一部分，我们对再生表皮上提取的DNA做了一次逆转录病毒整合位点基因组分析。 通过连接区介导[linker-mediated]（LM）巢式PCR生成了载体基因组文库，并测序至饱和[sequenced to saturation]。用这种方法，从第一和第四个月的活检中分别明确定位了36和26种在人类染色体上的独立整合。三种整合在两次检查中都有（详细的清单在网上的附表1中）。考虑到每个基因组中有两个前病毒副本（图2c）和<50%的总体克隆效率，我们估计在0.1cm2的再生表皮中至少有30种独立转染的干细胞。这个数目与正常表皮中的干细胞的估计值3,20差不多，这说明再生皮肤中的表皮干细胞几乎完全是基因矫正后的。

总体而言，17个整合（29%）是基因间的，21个（36%）在22个RefSeq基因的转录部分内部，20个（34%）在30个基因的上游或下游≦30 kb远处（附表1和2，在线）。击中的基因中，采用与转导相同的条件培养的角化细胞有63%表达（附表1）。超过30%的整合发生在转录起始位点上游或下游≦10 kb处，证实了已知的人类细胞中γ-逆转录病毒载体的整合倾向21。

这项研究表明基因矫正的表皮干细胞在体内再生了功能正常可自我更新的表皮。因为Timedsurgery的侵入性温和，可以在局部麻醉12下操作，体外基因治疗然后大面积的植皮是可行的。我们正计划对KEP25患者在2-3年内逐步更换全身表皮。

尽管临床上做表皮培养已经有20多年了20,22，正式验证培养自体干细胞做植皮却很 难。用整合的前病毒作为细胞克隆性的标记，我们已经表明，一定数量的干细胞个体在培养和移植中保持了功能，并在体内长期维持表皮的更新，与此同时由于表皮 的正常更新，多数过渡增殖祖细胞[transit amplifying progenitors]在一个月内会消失。这一点在临床上关系重大，烧伤病人的植皮失败通常在一个月内发生，但几乎不会在两个月或以上的时间里发生。我 们的数据表明，当培养表皮中没有保留住克隆源性干细胞的时候会发生早期植皮失败，只有自我更新的干细胞才能维持长期的皮肤再生22。

本试验的一个关键目标是评估在临床上使用MLV派生的逆转录病毒载体转染的表皮干细胞的安全性，最近因其无法控 制对人类基因组的插入产生的基因毒性引起了实质性的安全担心。实际上，一种T细胞原癌基因的插入激活已经与基因治疗的性连锁重症联合免疫缺陷（X- SCID）患者发生淋巴增殖性疾病关联了起来23。不过其它X-SCID（参见24），腺苷脱氨酶缺陷SCID（参见25），或移植物抗宿主 病的临床试验没有发现这种严重的不良事件，并且逆转录病毒的插入只在慢性肉芽肿病的情况下引起造血祖细胞的良性克隆增生27。这里我们分析了在两次不同时间患者随访中得到的皮肤活检的前病毒整合，虽然要得出确切的结论还太早，没有发现体内克隆性扩增或特定整合选择的证据。同样，在很多连续传代的转染后正常或JEB角化细胞培养中，我们也从来没有发现特定前病毒整合的克隆选择（附图2，在线；和F.M., G.P.和 M.D.L.，未发表资料）。最后，不同时间点不同植皮区域的整合事件的重复发生，说明患者植皮后的独立基因击中次数是有限的，可能有助于与造血干细胞移植相比较低的癌基因激活。

各种EB在全球大约影响到500,000人（http://www.debra.org）。本次首次临床试验的成功结果为其它EB亚型及其它遗传性皮肤病的基因治疗铺平了道路。

方法

详情载于网上的补充方法。

细胞培养，逆转录病毒载体及包装细胞系。3T3-J2细胞和Am12-LAMB3双嗜性包装细胞的培养方法见28，29。健康和JEB角化细胞培养在致死量辐射后的3T3-J2细胞饲养层上28。克隆源性鉴定和纯系分析的做法参见3，5，29。

在MLV LTR控制下表达3.6kb全长层粘连蛋白-332 LAMB3 cDNA的逆转录病毒，构建在MFG骨干30中，并在双嗜性Gp+envAm12包装细胞系中转染整合29。高滴度包装克隆（Am12-LAMB3 2/8）的主细胞库依据GMP/GLP标准由合格的承包商（Molmed S.p.A）制备。

基因矫正的表皮皮片制备和手术流程。I/II期临床试验是意大利卫生部和摩德纳大学的伦理审查委员会于2005年6月批准的。一名JEB患者，记为KEP25，知情同意参加。KEP25的角化细胞从左右手掌的两块儿皮肤活检（1.5cm2）中获得，按28中的方法培养。按28，29的描述，分汇合的原代细胞按1:2的比例接种（6 x 103细胞/cm2）到饲养层（8 x 104细胞/cm2）上。3天后，细胞转移到九个75cm2细颈瓶里的3T3-J2饲养层上并成长到汇合。皮片按12的方法用Dispase II分散酶（2.5mg/ml）分离。

接受植皮的区域用聚维酮碘溶液清洗和无菌生理盐水冲洗。按12中的方法，在局部麻醉下用编程 的diathermosurgery（Timedsurgery, Korpo）清除患者的LAM5-缺陷表皮。移植后的第1，4，6月做了打孔活检（0.4cm）。

免疫荧光，免疫沉淀法和Western印迹分析。这些实验使用LAM5-β3的单克隆抗体（anti-LAM5-β3）K140，LAM5-β3的抗血清sc-7651（SantaCruz Biotechnology），LAM5-γ2的单克隆抗体（anti-LAM5-γ2; Chemicon）D4B5，β4整合素的结合荧光素的[FITC-conjugated]单克隆抗体CD104（anti-β4 integrin; Serotec），和兔抗p63α抗体（参考17）。按17，18的方法对用多聚甲醛固定的皮肤样本和角化细胞集落做了免疫荧光分析。 用LSM510共焦分析仪[Confocal Analyzer]（Zeiss）做了共焦分析。按28中的方法对分汇合细胞做了免疫沉淀分析。Western分析按16的方法进行。

细胞毒性T细胞检测。用MFG-LAMB3逆转率病毒载体转染的自体T细胞或异体T细胞刺激，对移植后1和4个月后的外周血单个核细胞（PBMCs）做了细胞毒性T细胞分析。在第一次和第二次用[51Cr]释放实验刺激10天后做了杀伤活性测定。第三次在刺激10天后用用24-h ELISA测定了IFN-γ的分泌。在这两种实验里，刺激效应子的自体T细胞用MFG-LAMB3转染的自体EBV细胞系在不同效靶比（E/T）下激发。

原位杂交。地高辛标记的cRNAs合成遵照供应商的指导（DIG RNA Labeling Kit, Roche），杂交按前述17中的方法进行。带Sp6/T7启动子序列的引物序列（MWG Biotech）用于在体外转录中获取DNA模板。使用了下面这些载体特异性引物：5'-Sp6-AGTAACGCCATTTTGCAAGG-3' （熔点（Tm）60℃）和5'T7-AACAGAAGCGAGAAGCGAAC-3'（Tm 58℃）。Riboprobes感应用作阴性对照。

Southern，Northern和PCR分析。DNA从1-5 x 106个细胞中提取，用不同的限制酶消化（10μg），在0.8%的琼脂糖凝胶中转移到尼龙膜上（Duralon，Strategene），并与[32P] 标记的LAM β3特异性探针杂交。用于PCR分析的基因组DNA用载体特异性引物5'-TCGTACTCTATAGGCTTCAGC-3'和5'- AGACATGGAGTTGGAGCTGC-3'扩增，并溶解到1.3%的琼脂糖凝胶中。用盐酸胍法提取总RNA，在0.8%的甲醛-琼脂糖凝胶中电泳， 通过Northern毛细印迹转移到尼龙膜上并与LAM β3-特异性探针杂交。

逆转录病毒整合位点分析。按26的方法用LM-PCR克隆整合位点。简单来说，基因组DNA用MseI和PstI酶消化，连接到MseI双链连接区。用LTR和连接区特异的巢式引物做LM-PCR。PCR产物再用TOPO TA克隆试剂盒（Invitrogen）鸟枪法克隆成整合文库，然后测序至饱和。通过BLAT基因组浏览器（UCSC Human Genome Project Working Draft, May 2004; http://www.genome.ucsc.edu）把序列映射到人类基因组上。培养的角化细胞的基因表达谱用KEP25的1-2 x 106个角化细胞通过Affymetrix微矩阵分析确定，培养条件遵循前述的26，与转染相同。

注：补充资料在自然医学[Nature Medicine]杂志的网站上。[译注：在翻译的时候我找不到附图]

致谢

我们感谢图1b中显示的S. Bondanza做的KEP25角化细胞的克隆分析；K. Fleishauer做的HLA基因分型；及C. Rossi和D. Sartori的技术支持。我们也感谢H. Green（Harvard Medical School）提供的3T3-J2细胞； G. Meneguzzi（Institut National de la Sante ′ et de la Recherche Me ′dicale (INSERM) U 634）提供LAM5-β3的K140抗体并做图3d的免疫荧光实验。本工作受Telethon，AFM-Telethon和欧洲委员会（框架计划VI，SKINTHERAPY）资助。

作者分工

F.M.，G.P.和M.D.L.设计并指导了这项研究。GP进行了克隆分析，转染患者的皮肤细胞，并为植皮做了准备。 S.F，F.D.N.，E.D.I.和G.M.承担了组织学和分子学的 检查，GF和F.M.构建了逆转录病毒载体和包装细胞系，E.P.和C.B.做了免疫学分析，S.C.，A.C.，C.M.和A.G.做了移植手术并负责患者的临床管理。

竞争权益声明

作者声明他们没有竞争的经济利益。

网上发表的链接：http://www.nature.com/naturemedicine。

重印和权限的信息是在网上有：http://npg.nature.com/reprintsandpermissions/。

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