简介

大疱性表皮松解症是细胞角蛋白网络生成缺陷，或粘合真皮与表皮的蛋白缺陷导致的遗传性皮肤疾病(Pulkkinen and Uitto, 1999)。角蛋白-5和角蛋白-14组成细胞的蛋白骨架，角蛋白基因KRT5或KRT14上的突变导致单纯型大疱性表皮松解症（EBS）。EBS通常是显性遗传 (Bonifas et al., 1991; Fuchs et al., 1994; Porter and Lane, 2003)。角蛋白可以保护细胞免受机械张力损伤。EBS有一种隐性遗传亚型，伴随有肌肉萎缩，是由编码网蛋白的PLEC1基因突变引起的 (Uitto et al., 1996)。网蛋白是把细胞骨架蛋白和半桥粒连接起来的一种蛋白。交界型EB是编码半桥粒中蛋白的基因突变引起的，其中LAMA3，LAMB3或 LAMC2编码层粘连蛋白-332 (Aberdam et al., 1994; Baudoin et al., 1994; Pulkkinen et al., 1994a; Pulkkinen et al., 1994b; Vailly et al., 1995; Vidal et al., 1995b)；ITGA6和ITGB4 编码α6/β4整合素 (Ruzzi et al., 1997; Vidal et al., 1995a)；COL17A1编码BPAG2 / 17型胶原 (McGrath et al., 1995; Mellerio et al., 1998)。所有JEB都是隐性遗传的。营养不良型EB是由编码VII型胶原的COL7A1基因突变引起的，根据突变位置的不同可以是显性的也可以是隐性的。VII型胶原是锚原纤维的成分(Bruckner-Tuderman, 1999; Christiano et al., 1995a; Christiano et al., 1994; Christiano et al., 1995b; Hammami-Hauasli et al., 1997; Hilal et al., 1993; Hovnanian et al., 1994; Hovnanian et al., 1997; Uitto et al., 1994; Winberg et al., 1997)。

基因疗法通过纠正致病基因达到治疗目的

显性和隐性两种遗传方式对应的纠正方式不同。对隐性遗传而言，只要纠正两条基因中的一条就可以纠正细胞的错误表现。当前的基因疗法最适合这种情况。主要的问题是如何使基因纠正过的细胞长期生存并且相应基因长期表达。在显性遗传中，除非是单倍体的缺陷，否则只有一个正确的基因细胞表现仍不正常。而EB的突变不是发生在单倍体上。大多数显性遗传疾病是由突变后蛋白的显性负效应引起的，突变产生的"毒性蛋白"使正常的同种或异种聚合物无法起作用。

严重联合免疫缺陷(SCID)基因疗法案例中得到的教训

隐性遗传疾病的基因疗法需要把一份正常的基因传导到受疾病影响的细胞中。为使治疗长期有效，把治疗基因传递到表皮的干细胞中至关重要，只有干细胞才能持续再生皮肤。用于矫正EB细胞的方法有几种，通常需要用病毒或非病毒的方式把能正确编码缺陷蛋白的基因传递到细胞中。尽管非病毒的方法听起来不错，但他们的效率和可行性比用病毒协助基因传递要低。病毒方法在体外和体内基因传递中都已证明是有效的，其中逆转录病毒和慢病毒携带治疗基因的能力出众，是最适合的载体。

最近巴黎Necker医院Alain Fisher教授的团队成功的用逆转录病毒治疗了患连锁严重联合免疫缺陷的年轻患者(Cavazzana-Calvo et al., 2000)。但10名患者中的3个患上了特殊的白血病，给这一成功蒙上了一层阴影。在这3名患者身上，逆转录病毒激活了与治疗基因临近的致癌基因 (Hacein-Bey-Abina et al., 2003a; Hacein-Bey-Abina et al., 2003b)。现在已经找到了更安全的逆转录病毒和慢病毒来解决这个问题。这些自灭活的载体本身不包含可以激活致癌基因的调节因子，因此可以大幅度降低治疗基因整合后的致癌风险。这种新的载体已经可供临床使用。

单纯型大疱性表皮松解症(EBS)

EBS是由编码角蛋白-5和角蛋白-14的KRT5和 KRT14基因突变引起的，多数是常染色体显性遗传。突变产生的蛋白在细胞中有毒性，因此基因疗法必须抑止突变基因的表达。尽管已经有使基因沉默的方法，但设计使特定基因沉默的策略还很困难，有时候正常基因和突变基因只差一个核苷酸。这种方法已经存在，但无法规模应用，因为几乎对每一个病人都需要特殊设计并且疗效无法预知。敦提大学Birgit Lane教授所属实验室的最新结果，给了EBS治疗一些希望(D'Alessandro et al., 2004; Magin et al., 2000)。由于角蛋白的正确基因无法治愈疾病，把编码肌间线蛋白（中间丝蛋白的一种，类似于角蛋白）的基因传递到培养的EBS角化细胞中。正常时只有肌肉细胞才生成肌间线蛋白，它与角蛋白类似，对机械张力起保护作用。接受了人体肌间线蛋白基因的EBS角化细胞对外力的反应有了变化。这种方法避免了为每种角蛋白突变设计专用的基因疗法，有望为所有受严重EBS（比如EBS-DM）折磨的患者缓解症状。

交界型大疱性表皮松解症 (JEB)

不止一个小组报道过在试管中重建JEB角化细胞半桥粒的消息。首先突破的是直接修改角化细胞的基因从而生成正确的层粘连蛋白-332的γ2链 (Gagnoux-Palacios et al., 1996)。最近，通过逆转录病毒(Dellambra et al., 1998; Robbins et al., 2001; Seitz et al., 1999; Vailly et al., 1998) 或非病毒的方法已经可以使原JEB角化细胞产生17型胶原或层粘连蛋白的β3链。非病毒的方法是使用ΦC31整合酶或转座子引导基因传递(Ortiz- Urda et al., 2003b; Ortiz-Urda et al., 2003c)。在上述例子中，17型胶原和层粘连蛋白-332的重新表达提高了缺陷角化细胞的粘附特性并且使细胞群落的生成更快。修正后的细胞仍保留了极性和分化潜能，并恢复了产生半桥粒的能力。但是从上述基因疗法的原理发布以来，还没有临床应用的报道。

隐性遗传营养不良型大疱性表皮松解症（RDEB）

由于COL7A1的互补DNA（cDNA）特别大（9kb），RDEB的基因治疗也比较困难，没有病毒载体可以把9kb的cDNA携带到细胞内部。最近在载体方面的进展使两个小组分别实现了矫正RDEB患者身上提取的角化细胞。

体外矫正角化细胞

Paul Khavari的小组使用了非病毒的基因传递体外矫正RDEB角化细胞。为保证移植的基因长期表达，他们使用ΦC31整合酶把COL7A1 cDNA添加到人类8号染色体上。角化细胞中同时也移植了包含COL7A1 cDNA和一种耐抗生素（杀稻瘟菌素）的质粒，和一种包含ΦC31整合酶的质粒。随后他们用抗生素对角化细胞进行选择 (Ortiz-Urda et al., 2002)。Woodley的小组使用了一种自灭活的慢病毒载体，把COL7A1 cDNA传递到 RDEB角化细胞中，使用改良的逆转录促进剂来避免治疗基因失活(Chen et al., 2002)。上述两个例子中，矫正过的细胞随后都被植入到免疫抑止的小鼠身上并观察到基因矫正过的皮肤在体内生成了锚原纤维。这些研究证明基因传导可以用来治疗隐性遗传性皮肤病，并提供了可以继续优化的方法。最近Gache和他的同事已经用传统的逆转录病毒把COL7A1 cDNA和耐抗生素基因传导到了RDEB角化细胞中 (Gache et al., 2004)。传导后的细胞用Zeocin抗生素筛选以提高好细胞比例。然而Paul Khavari小组的研究中用杀稻瘟菌素进行细胞筛选，为此引入了非人类的基因，这种方法在临床上难以接受。

体外矫正纤维原细胞

Ortiz-Urda及其同事和陈及其同事证明我们可以把正常人的纤维原细胞或基因矫正过的RDEB纤维原细胞注射到等价于RDEB人体真皮的裸小鼠移植皮肤上 (Ortiz-Urda et al., 2003a; Woodley et al., 2003)。注射到真皮后，这些外部细胞合成并分泌了VII型胶原并在真皮-表皮交界处组成了锚原纤维，时间长达3个月。

矫正角化细胞和矫正纤维原细胞相结合

上述数据显示真皮或者表皮上进行的体外基因矫正都可能有效。但是一些未发布的数据表明从皮肤的下层可能会向伤口处迁移一些基因没有矫正过的表皮干细胞，这会使移植的效果减弱。因此像严重烧伤病人那样移植包括基因矫正过的表皮和真皮的整个皮肤系统，而不是单独的一层，可能是更有效的方法。这种方法在烧伤病人中已经用过，只是基因没有修改过 (Llames et al., 2004)。

蛋白疗法，基因疗法之外的选择？

陈及其同事已经表明对等价于RDEB人类皮肤的裸小鼠皮肤真皮注射重组的VII型胶原可以治愈疾病 (Woodley et al., 2004)。注入的重组VII型胶原移动到了真皮和表皮的交界并形成锚原纤维。这一系列试验说明蛋白疗法对RDEB患者可能是基因疗法外的另一种选择 (Woodley et al., 2004)。但VII型胶原是否是一种稳定和长寿的分子以及锚原纤维的更新率仍然未知。因此注射的份量和频率仍然需要研究。

结论和展望

过去四年在体外治疗和体内治疗方面都取得了重要进展。毫无疑问，在不久的将来使用安全的逆转录病毒或慢病毒载体可以实现对JEB和RDEB的临床试验。病毒传导的基因疗法和蛋白疗法可以相互结合，给大多数隐性遗传的患者提供有效的治疗。当然，仍有一些问题需要解答，比如原先完全缺乏一种蛋白的人对新生成的或注射的蛋白的免疫反应。最后，对显性遗传的EB的治疗仍是一大挑战，需要基础研究和技术上更多突破。仍有困难需要克服，但重要的步骤已经完成，使开发 EB的治疗方法充满希望。

大疱性表皮松解症基因疗法的现状（2005年5月）

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