多处矫正性LAMB3第二位点突变引起的交界型大疱性表皮松解症的回复镶嵌
原作者：安娜[Anna M.G. Pasmooij]，Hendri H. Pas，Maria C. Bolling，和 Marcel F. Jonkman
荷兰，格罗宁根，格罗宁根大学医学中心，皮肤科，大疱病中心
翻译：周迎春。初次翻译：2010年11月。最后更新：2012/12/30 。
已经有过关于遗传性大疱性表皮松解症基因KRT14和COL17A1的遗传性突变在体内反转引起回复镶嵌的报道。这里我们展示了在无关联的两名有回复镶嵌的JEB-nH患者身上存在多处第二位点突变，都能纠正遗传突变LAMB3:c.628G→A;p.E210K。 两名患者在病变的皮肤中都表现出严重的层粘连蛋白-332减少。 特别的，患者078-01（c.628G→A/c.1903C→T）的小腿皮肤逐步临床好转，在以前患病的皮肤中表现出层粘连蛋白-332。另一位患者， （c.628G→A/c.628G→A），在胳膊、肩膀和胸部有回复皮片。DNA分析显示在不同的切片样本上的回复角化细胞中的第二位点突 变不同（c.565-3T→C， c.596G→C;p.G199A， c.619A→C;p.K207Q, c.628+42G→A，和c.629-1G→A），说明对于特定的突变并不存在单一的优势回复机制。由于回复镶嵌的发生频率看来比我们预期的要高，我们的数据展示了在一种特殊情况下治疗EB的前景。这使对有镶嵌的LAMB3基因EB患者使用自体天然矫正的角化细胞，绕开基因重组矫正阶段，实施回复细胞疗法成为可能。
导言
种系细胞或遗传病患者的体细胞的致病突变的回复性突变能重新表达相关的蛋白质，从而使表现型从患病变成正常。这些回 复突变可以是真正的逆向突变，产生野生型序列和野生型蛋白质，也可以是增加第二位点突变来补偿遗传的初次突变的功能。在第二种情况下，氨基酸序列中可能发 生微小的变化。在不同的遗传疾病和不同的细胞类型中已经发现有回复镶嵌，如肝细胞、淋巴细胞和EB的角化细胞。EB是一组临床上不同源的遗传性水疱疾病， 导致皮肤和粘膜脆弱。JEB亚型，特征是表皮基底膜的透明板处分离，由编码XVII型胶原COL17A1，整合素α6β4（ITGA6和ITGB4），或 层粘连蛋白-332（LM-332；LAMA3，LAMB3，和LAMC2）的基因的隐性遗传的突变引起。最近，报道了第一例对携带层粘连蛋白 β3（LAMB3）的杂合体通过移植基因矫正过的皮肤干细胞治疗EB皮肤的案例。
EB患者的COL17A1和KRT14基因回复镶嵌已经见于报道。第一例报道涉及一个缺陷的COL17A1等位基因在有丝分裂中反转成野生型序列的基因转变。第二例EB患者，XVII型胶原在局部皮肤中的出现是COL17A1的第二位点移码重构突变[frame-restoring mutation]。最近，我们揭示了在两名患者身上的好皮肤块儿中的不同XVII型胶原中存在多种矫正性COL17A1突变。EB症状的改善也可以通过 RNA水平上的外显子跳跃实现，尽管这种机制通常涉及全身皮肤，没有皮肤镶嵌。在本研究中，我们描述了两名JEB患者，看起来由LAMB3基因上的种系突 变引起了回复镶嵌。患者078-01的左侧小腿皮肤原来很脆弱，但是由于产生了大量的LM-332分子而不再发生水疱。两名患者独立的皮肤切片突变分析揭 示了存在至少5种体内第二位点LAMB3突变，都能矫正 同一种遗传的c.628G→A突变。
结论
患者078-01。 患者是46岁的男性，1999年到我们EB中心就医，具有典型的全身性JEB-nHZ特征。父母非近亲，兄弟姐妹没有病。也没有家族皮肤病史。患者自出生 起就表现出全身性的摩擦引致皮肤水疱，愈后有萎缩和色素沉着。手脚指甲短小。头发稀疏，有男性的秃顶，胡须轻度脱落，眉毛、睫毛和次生毛完全缺失。患者所 有牙齿都有釉质缺损（釉质形成不全症），在20岁时拔掉了。值得注意的是，患者声称经过了糜烂性的7年之后，原来受到轻微摩擦就会有水疱的左侧小腿皮肤， 愈合成了健康的皮肤，不再因摩擦发生水疱（图1）。表现型的回复发生在出生后，因此被归入晚发型回复镶嵌。他另一条腿（右腿）发生了多处鳞状细胞癌，在 1998年做了截肢。一年后转移到淋巴结和肺部，导致患者死亡。
对含水疱皮肤切片I（突变皮肤[M]）的免疫荧光抗原定位显示水疱在表皮下形成，分离面在透明板下，是JEB典型的 LM-332不足。XVII型胶原只出现在水疱顶，VII型胶原在水疱底。LM-332在底和顶都有，但是量少。无伤带病皮肤切片II（M）显示在表皮真 皮交界处LM-332特异的单克隆抗体GB3和K140（图2，A和B）的结合减少，以及19-DEJ-1结合缺失，这是JEB的标志。值得一提的是，切片II（M）的一部分存在一小块儿大约25个回复基底膜细胞显示出正常的LM-332染色，与正常同年龄的对照皮肤（图2C）接近。有 意思的是，两块儿无病的皮肤切片都显示出正常的LM-332着色。切片III（回复皮肤[R])显示出正常（3+）和不足（1+）着色的镶嵌图样（图 2D），而切片IV（R）是完全正常的3+着色（没有附图）。与这些发现一致，19-DEJ-1的着色在切片III（R）上呈间断性的阳性，在切片 IV（R）上完全正常。
含水疱皮肤的电镜观察显示与JEB一致的透明板下的皮下水疱。水疱的底由致密板覆盖，在水疱空腔中有张力丝残留。无疱的患病皮肤显示半桥粒发育不 良且数量不足，放射出的张力丝也比正常皮肤少（图3A）。透明板有很多重叠和盲“突出”。相反，回复皮肤上的半桥粒形状正常，透明板上重叠和突出较少（图3B）。
我们对编码LM-332三条链的LAMA3，LAMB3，和LAMC2做了突变检测。序列分析发现患者的染色体组DNA的LAMB3基因上有两处杂合突变：外显子14上的c.1903C→T;p.R635X；和外显子7上的c.628G→A;p.E210K联合无义突变。由于后者发生在内含子7的5' 剪接供体 的-1位置上，可以预见到它会影响mRNA的剪接。
为了研究回复机制，通过激光显微切割把k140免疫着色的突变（表达减少）和回复（表达正常）角化细胞分离。对含突变的外显子7和14，以及临近的外显子 6，8，13，15（图4A）做了DNA分析。在小腿切片IV（R）中，外显子7和14的两个突变仍然存在。离遗传突变不远，我们发现在内含子7上有一个 第二位点突变c.628+42G→A，在外显子/内含子7边界下侧42个核苷酸的位置（图4C）。由于带回复镶嵌的切片III（R）也是取 自小腿，我们预期在回复角化细胞中发现同样的第二位点突变。意外的是，没有发现c.628+42G→A；而是在外显子7上发现了另一个核苷酸改变 c.596G→C;p.G199A（图4B）。克隆测序显示这个多出来的变化（c.596G→C）和遗传的含剪接位点突变外显子7在同一个等位基因上。在 这两块儿回复切片样本上没有其它核苷酸变化。另外，在从同一切片上取的纤维原细胞和80个对照样本的DNA上，没有发现补偿性的第二位点突变。遗憾的是， 切片II（M)上的25个回复细胞数量太少，做DNA分析 不成功。只分离出一个样本，而我们通常对至少3个独立分离的样本做测序。
为了确定种系突变和多出来的替换对mRNA剪接的作用，我们直接从相应切片分离了RNA。然后通过巢式RT-PCR，用扩增LAMB3 DNA核苷酸580-848的外引子合成和分析了cDNA。在全长mRNA转录（269-bp扩增引物）之外，从带病皮肤上分离的RNA显示出3种异常mRNA转录：（i）异读框[out-of-frame]转录，少了外显子7；（ii）转录少了外显子7和外显子8的前2个核苷酸（AG）；和（iii）整码[in-frame] mRNA转录，少了外显子7和外显子8的前101个核苷酸（图5，A和B）。这3种分别少了64，66，和165个bp的mRNA转录以前普尔基宁[Pulkkinen]等人也曾经在628G→A突变中描述过。我们的扩增设备无法检测第四种少了210个碱基对的转录。
有意思的是，在切片IV（R）分离的RNA中可以看到一个缓慢的扩增迁移。随后克隆和测序显示在335-bp的产物中保留了内含子7的前66个bp（图 5B）。以前的研究中，镶嵌皮肤切片样本的RNA分离通过染色每第四个组织切片并用染色图样来选择想要的细胞供进一步的激光显微切割分离。这种方法需要突 变和回复的细胞带足够长。由于在切片III（R）中，染色的亮暗变化间距非常短，有时只有10个基底膜细胞（图2D），我们转而选用整个切片做RNA分 析，这样大约50%是正常细胞 ，50%是LM-332着色不足的细胞。与我们希望的一样，切片III（R）的RNA转录的mRNA（图5A，第4道）分布与带病皮肤切片不同。这种由外 显子7的最后一个核苷酸迁移导致的剪接产生的扩增引物不够丰富（图5B，c-e转录），而正常剪接的269-bp扩增引物占上风。这些正常长度的扩增引物的克隆显示出几乎所有克隆都携带了c.596G→C和c.628G→A。
通过用寡核苷酸扩增LAMB3 cDNA的bp c.1903C→T;p.R635X，在另一个遗传突变c.1903C→T;p.R635X附近也做了巢式RT-PCR。普通人对照样本有一个清晰的589-bp扩增产物，而所有的患者切片都显示出这一产物减少（图5D）。由异读框[out-of-frame]转录删除外显子14（379bp）而产生一个额外的快速迁移210-bp扩增引子，因此易发生无义介导的RNA衰败。带病和无病皮肤切片的mRNA或DNA没有区别。因此，遗传性p.R635X的回复没有发生。
患者029-01。 第二位有遗传突变的JEB-nH患者在本文发表时64岁，他的情况其它文章也有介绍。他父母是近亲，健康，不过他的姐妹也患病。祖父母辈是表亲。无伤带病 皮肤样本的免疫荧光测试表明LM-332的表达严重减少，而XVII型胶原的着色正常。与这种情况一致，无伤带病皮肤的电子显微镜分析显示半桥粒发育不 良。突变筛查找到了纯合子c.628G→A改变。
因为我们已经观察到多名EB患者的回复，我们在自己的EB诊所例行询问他们是否有临床不发病的皮肤块儿。2006年 年初，患者029-01说他胳膊、肩膀和胸部有几处不发病的区域（图6）。遗憾的是，他记不清这些地方出现多久了，也不清楚他们的面积是否逐渐增大。也没 有老照片。所有4块无病皮肤切片的免疫荧光显微镜观察都发现比正常对照皮肤更明亮的角化细胞着色（数据没有展示），因此证实他是另一例有回复镶嵌的EB患 者。与上述发现一致，在回复的皮肤上半桥粒的数量正常，而突变皮肤上数量很少。
随后对回复角化细胞通过外显子5-9的巢式PCR做的DNA分析揭示出不同切片样本的不同第二位点突 变：c.565-3T→C， c.619A→C;p.K207Q，和c.629-1G→A。这些在着色不足的角化细胞中没有，在对照的160多个染色体中也没有（图7）。尽管对切片 II（R）做了很多外显子5-9测序，还是没有找到回复的机制。很可能存在另一种第二位点突变，因为回复的细胞仍然有纯合的c.628G→A突变（数据没 有展示）。
第二位点突变对mRNA的作用通过用扩增核苷酸580-848的引子做RT-PCR进行了研究（图8）。与只含 c.628G→A突变的带病皮肤相比，含c.619A→C和c.628G→A突变的切片I（R）中269-bp的扩增引子浓度提高了（图8，第1道）。另 外两个切片中，II（R）和III（R），mRNA的分布也朝全长mRNA转录的方向变化了。在切片IV（R）中，c.629-1G→A突变处于内含子7 的受体剪接点位，产生了更多整码[in-frame] 66-bp删除的转录（图5B，d）。这种短的整码转录产生了一种小，但可能有功能的LM-332蛋白，可以回复皮肤功能。
讨论
据我们所知，这次对两名JEB-nH患者的研究是对LM-332回复机制的第一次描述（图9A）。多种第二位点突变 的发现再次证明单个人可以经历多次回复突变。所有的回复机制都涉及DNA上的核苷酸改变：c.565-3T→C， c.596G→C;p.G199A， c.619A→C;p.K207Q， c.628+42G→A， 和c.629-1G→A（图9B）。第二位点突变影响到RNA并进而影响蛋白质。
外显子7（c.628G→A）最后一个碱基对上遗传的G→A突变把带负电的谷氨酸末端改成了带正电的赖氨酸（p.E210K）。 这个替换发生在LM-332 β3链短臂上的N-端球状域，这个位置已经被公认为对LM-332与基底膜组织中的其它蛋白质，包括层粘连蛋白-311，的连接至关重要。这种极性改变可 能干扰LM-332的蛋白-蛋白相互作用，降低表皮-真皮的粘合。由于核苷酸-628的改变发生在5'剪接位点的共有序列中，它对mRNA的剪接产生了更 深刻的影响。根据普尔基宁[Pulkkinen]等人的描述，c.628G→A突变产生了4种错误的转录。RNA片段由5'供体剪接位 点，3'受体剪接位点，和受体剪接位点上游18-40核苷酸位置的分支点序列控制。在人类基因组中，这些剪接序列的保护不强；只有内含子5'端的GT，内 含子3'端的AG，和2'位置的分支点腺苷几乎不变。既然天然的剪接位点可以与共有序列不同，剪接位点强度和辅助调节序列都可以影响剪接位点的选择。网上 有各种预测剪接 位点的资源，比如https://splice.cmh.edu的自动剪接位点分析。用计算机分析我们的LAMB3基因序列显示c.628G→A突变使天然受体位点的信息量（Ri,[individual information content]）从8.2减少到了5.1比特。除5'剪接位点外，在被分析的序列中还有其它两个受体位点的Ri值比较高。这些位点是TGG|GT，Ri是4.3比特，和CAG|GT，Ri是3.2比特，分别位于天然外显子/内含子7的边界下游37和66核苷酸处。
第二位点突变c.628+42G→A把另一个受体位点TGG|GT的Ri值从4.3大幅度的降低到0.8比特，而 CAG|GT位点保持3.2比特不变。TGG|GT受体位点的变弱可能会使剪接体倾向于使用隐蔽位点CAG|GT，因此产生了我们观察到的大量保留了内含 子7前66个核苷酸的mRNA转录。这个整码[in-frame]插入导致22个氨基酸— SQCGYFSCPWNYGWKRKQSWSP —增加到β3链的N端。尽管这一段含有2个带碱性侧链的氨基酸，4个带酸性侧链，6个带大芳香族侧链，这样产生的LM-332明显是有功能的，因为皮肤的表现回复了。
第二位点c.596G→C在氨基酸位置199把甘氨酸改成了丙氨酸，第二位点c.619A→C把位置207从赖氨酸 改成了谷酰胺。更重要的是，他们都影响mRNA的剪接，因为在回复细胞中有更多正常长度的转录。计算机分析没有发现对剪接位点Ri值的影响。我们也用 RESCUE-ESE软件（http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese）排除了突变改变外显子剪接增强子（ESE，[exonic splicing enhancer]）序列的可能性。当处于3'剪接位点下游和/或5'剪接位点上游的时候，ESE能帮助剪接。第三种可能影响剪接位点选择的因素是这些第二位点突变对含c.628G→A突变的RNA二级结构的可能作用。单核苷酸的改变可能影响到RNA的二级结构，进而影响RNA剪接。
在内含子7的野生型3'受体位点下游2个核苷酸处，有一个GAG|GT隐蔽剪接位点。因此c.628G→A不仅产生 了一种删除64-bp的转录，还产生了一种删除66-bp的转录。第二位点突变629-1G→A把天然受体位点的强度从10.5降低到了2.9比特。而隐 蔽剪接位点从6.0增强到了7.8比特。RT-PCR分析确实发现隐蔽剪接位点的优先使用产生了整码转录，而不是异读框转录。转录产生了一种小的，有功能的β3多肽，在短臂的N端域少了22个氨基酸。最后一个第二位点突变c.565-3T→C位于内含子6的3'剪接位点，略微增加了Ri值，从5.3到5.6比特。尽管改变不大，它可能是野生型mRNA增多的原因。
另一个遗传的突变p.R635X，是欧洲JEB患者最常见的突变，预示着在LM-332蛋白质的螺旋杆状区有一个提前终止密码子（PTC）。预期对应的转录水平会由于无义介导RNA衰坏而明显减少。外显子14附近的RT-PCR确实显示出普尔基宁[Pulkkinen]等人指出的589扩增引物表达减少。另外，患者078-01还检测到一个小的210-bp扩增引物变迁，属于一种缺少外显子14（379核苷酸）的异读框转录。尽管这种无益的转录以前没有报道过，但PTC导致的外显子遗漏并不少见。
一年前，几个研究小组独立的发现在一个人体内发生多处回复的现象，从而改变了回复镶嵌只发生一次的观念。对于I型酪氨酸血症的FAH基因，Omenn综合征的RAGI基因，严重联合免疫缺陷病的CD3ζ基因，EB的COL17A1基因，和这里的EB LAMB3基因，都观察到多处体内回复。遗传疾病中确认的补偿性第二位点突变数量快速增长。和田[Wada]等人描述了一名患者有6处不同的第二位点突变，都能纠正同一个RAGI基因的delC突变，而Rieux- Laucat等人发现了3个体内第二位点突变都使CD3ζ基因的无义密码子p.Q70X回复成一个 错义密码子。这些患者的多种第二位点突变机制还不清楚。如同向重复或同型核苷酸片段这样的突变热点能提高回复突变的频率。因此，我们分析了第二位点突变附 近的序列。Levran等人发现的一些点突变附近的CAGG/CCTG突变热点序列不在任何一个第二位点突变的邻域（邻域定义为10个核苷酸的距离）。对 596G→C，619A→C，和628+42G→A发现了同型核苷酸片段，对629-1G→A发现了短同向重复，这表明突变主要由偏移介导的错误引起。
两名患者都没有做过化疗或放疗，排除了它们导致突变的可能性。因为患者没有暴露于日光下，并且5个第二位点突变中只 有2个有典型的紫外线突变C→T和G→A，所以也可以排除紫外线。因此这些患者的矫正性DNA变化的原因还无法确定。可能是完全随机的突变，或是一种未知 的补救机制，这里描述的回复数据倾向于后者。
支持随机突变的理由。Nachman和 Crowell估计人类的突变率是每一代的二倍体基因组平均有175个突变。很可能我们的患者突变率高，从而在角化细胞中积累了有利的第二位点突变。其它 基因中或其它细胞的突变对细胞没有好处，因而消失了。相应的，在周边的血液或纤维原细胞样本中没有发现第二位点突变。这种突变率的增加可能是看护基因失活 的结果。失活导致基因不稳定，突变率的提高影响到所有基因。根据这种假设，我们注意到两名患者都发生了癌症，而癌症是由体内突变的累积造成的。
支持定向诱发突变的理由。 杂合体患者078-01的3种第二位点突变都能纠正同一个628G→A突变。没有发现其等位基因上的1903C→T突变有第二位点突变。Bliksrud 等人介绍的FAH基因患者也是杂合型，结果和我们的情况相似，两个体内的回复都发生在同一条等位基因上。回复机制的执行不需要知道恰当的野生型序列。杂合 子患者的另一条等位基因上有正确的序列信息，这一点可能不支持上述判断，但纯合子患者没有这种情况。患者029-01，有纯合子628G→A，发现了4种 第二位点突变。并且Wada等人描述的患者有6种回复，Rieux-Laucat等人描述的患者有3种回复，他们都是纯合子。以前还有其它纯合型和杂合型 患者体内回复的案例。
我们最近报道了JEB-nH患者XVII型胶原的回复镶嵌。这些COL17A1镶嵌患者的回复皮片终生保持稳定，不 扩张。显然，回复的干细胞和有缺陷的相比没有选择优势。因此我们推论产生数十平方厘米健康皮片的矫正性突变发生在胎儿期。而这里介绍的LAMB3镶嵌患者 情况不同。据患者078-01说，他的回复性皮片面积在增长，而患者029-01没有注意到健康皮肤面积扩大。这一差别的原因可能是患者 029-01（c.628G→A/c.628G→A)缺陷细胞的LM-332含量比患者078-01（c.628G→A/p.R635X）更高，因为后者含无义突变的纯合子无法制造LM-332。从而，由于缺陷细胞劣势更大，患者078-01的回复角化细胞比029-01更容易扩张。
LM-332在伤口愈合中参与细胞的运动和迁移。与α2β1和α3β1相互作用对细胞的附着、扩散和迁移很重要，而 与α6β4相结合造成稳固的锚定，细胞不再扩散。另外，对口腔鳞状细胞癌细胞种系抑制内生的LM-332导致细胞附着降低，扩散增加。回复的好处可能与 LM-332对迁移的影响有关；不过这种潜在的LM-332回复干细胞选择优势还需要深入研究。
遗传疾病的治疗似乎还要靠基因疗法。Mavilio等人最近发表了通过转导表达β3 cDNA的逆转录载体纠正缺乏LM-332的DEB的一期临床试验。一名36岁的男性在移除最外层皮肤后双腿接受了培 养的表皮皮片的移植。移植是成功的，在随后的第一年中，水疱、感染、炎症和免疫反应都没有了。回复镶嵌给患者使用自体自然回复细胞做“回复细胞疗法”提供 了一种奇特的可能性。对带有LAMB3回复镶嵌的患者，我们可以利用患者自身回复的细胞做皮肤移植。这种自体细胞疗法省去了分子 水平上基因矫正的阶段。一般认为回复镶嵌是罕见的现象，但我们最近的发现显示它发生的频率可能比预期的要高。
方法
切片点。 患者078-01取了4块4-mm的皮片，速冻后做免疫荧光显微镜。一块取自左上臂带病且有伤的皮肤（切片I[M]）；一块取自左上臂带病但无伤的皮肤 （切片II[M]）；两块取自左小腿无病的皮肤（切片III[R]和IV[R]）。为电镜取了3块2-mm的皮片。一块取自左上臂带病且有伤的皮肤；一块 取自左上臂带病但无伤的皮肤；一块取自左小腿无病的皮肤。
第二位患者，029-01，曾在别处被介绍过，他是Jonkman等人的著作中的9号患者，普尔基宁[Pulkkinen]等 人著作 中的2号患者。为免疫荧光显微镜取了六块4-mm的皮片：无病的右肩一块（切片I[R]），无病的右胸一块（切片II[R]），无病的右前臂一块（切片 III[R]），无病的右上臂一块（切片IV[R]）。带病无伤的左上臂两块（切片V[M]和切片VI[M]）。为电镜取了两块2-mm的皮片：带病无伤 的左上臂一块，无病的右上臂一块。根据格罗宁根大学医学中心伦理委员会和赫尔辛基宣言的要求，两名患者对材料和照片的学术使用都知情同意。
皮肤和培养的角化细胞的免疫形态学分析。 免疫荧光显微镜、电镜和角化细胞培养的细节已经在别处有了详细的描述。为了检测LM-332，使用了两种抗体：针对β3链的K140和识别γ2链构象抗原 决定基的GB3。我们用单克隆抗体19-DEJ-1作为JEB的标志。XVII型胶原用1A8C和1D1染色，VII型胶原用LH7:2。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠标记抗体IgG用于后续标记。
皮片中DNA和RNA的分离。如前所述，通过激光显微切割对DNA取样。单克隆抗体K140用于区分角化细胞的正常和不足着色。在0.2-ml的试管中收集了大约200个细胞用于DNA分离。在55℃下用蛋白酶K水解60分钟，然后在98℃下 对蛋白酶K灭活15分钟。最终产物用于PCR。用100 μl的裂解缓冲剂加0.7 μl的β疏基乙醇裂解10-μm的皮片做RNA的分离。所有RNA（15μl）随后用Stratagene公司的RNA Microprep kit处理。cDNA的合成用到了别的方法（参考文献10）。
激光显微切割样品的突变确认。 我们用巢式PCR对激光显微切割分离的DNA做LAMB3突变检测。一微升的一次PCR产物用于二次PCR。PCR循环条件是94℃下5分钟，随后在 94℃下45秒、55℃下45秒、72℃下1分钟循环35次，最后在72℃下停留7分钟。用水做 阴性对照。扩增图同LAMB3外显子的引物序列和预期产物大小列在附表1中（本文的补充材料在线：doi:10.1172/JCI30465DS1）。 PCR之后，14 μl样本用1.5%的琼脂糖凝胶检查。格罗宁根大学医学中心遗传医学系提供了85份对照染色体组DNA，排除了检测出的第二位点突变是罕见遗传多态的可能 性。所有捐献者都知情同意。同时，分离的细胞的cDNA样本也做了巢式PCR。所有引子的设计都使PCR产物包括多个外显子的序列（附表2）。所有PCR 分析都用3次激光显微切割分离的核酸做了重复。PCR产物克隆成了pCR4-TOPO载体（Invitrogen公司）。对每一个回复切片样本，选择并测 序了10个以上的克隆。
登录号。人LAMB3基因的GenBank登录号是U17744–U17760。
致谢及参考文献
略
